细菌生物膜和健康

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  什么是生物膜？它是一种群居的生命形式，使微生物（如细菌等单细胞生物）以群体的方式行事。生物膜通常附着在一个支撑物上，而且无处不在。事实上，这是几十亿年前海底生物最初形成的方式之一。大多数细菌感染涉及生物膜，这有利于慢性病的发生，并导致治疗困难。目前还没有制定出有效的战略，但是，如果能更好地了解这些聚集物的形成和维持所涉及的机制，就有可能在不久的将来制定创新和有效的办法。

1. 生物膜或单细胞生物如何组成群落

   17世纪，荷兰商人安东·范·列文虎克[1]首次发现了细菌群，他发明了显微镜透镜并分析了牙菌斑样本（图1）。他用这种仪器来计算编织物中的线纹数量及其厚度。他的主要想法是观察周围的环境，他是最早使用显微镜探索微生物世界的科学家之一。

  但直到很久以后，“细菌膜”和“生物膜”才开始普及，尤其是J.威廉·科斯特顿在20世纪80年代出版的作品中提到[2]。科斯特顿是加拿大微生物学家（1934-2012），对水生环境中的细菌特别感兴趣。他指出，与现有的数据相反，细菌的主要生命形式是以多细胞生物相关的复杂群落形式存在的，他称之为生物膜。

  生物膜被定义为每克脱水物质含有多达1亿个(108）至100亿个（1010个)微生物细胞的有组织的聚集物。在这些结构中，细菌细胞被一种基质所包围，这种基质是由细菌自己产生的，确保在整个群落的凝聚力方面起着主要作用，有时还能附着在固体基质上。

  大多数细菌都能形成生物膜，少数细菌个体形成复杂的异质聚集体的不同步骤已被广泛描述

1.1. 生物膜形成的阶段

  最初的粘附使一些细菌附着在表面；随后是一个早期发育阶段，在此期间，细菌分裂、合成和分泌基质的成分，主要是糖、蛋白质和DNA。基质的存在参与了生物膜内细菌的空间组织，确保了复合物的稳定性，并允许建立内部流体循环通道。由于包含所有的微生物，基质还提供了与外部环境的界面，因此具有保护功能。它也是包括水在内的营养物质的来源，是营养物质(钙，铁，…)的储存地和细胞外酶活动的场所。[3]

  生物膜形成的下一步，称为成熟阶段，允许三维结构的发展与异质环境的建立，在此环境中，细菌以竞争或协同作用的形式进化或相互作用。

  最后，最后一步包括扩散阶段，一定数量的细菌从生物膜中分离出来，要么是被分离出来的，要么是以微聚集物的形式，这些微聚集物很可能会在其他表面定植。

1.2. 生物膜的特性

  生物膜基质也是细菌之间交换，建立通信网络的场所。因此，通过所谓的“群体感应”分子(参见细菌之间的对话与合作)，群体内的所有成员在超过细胞浓度阈值的情况下协调它们的反应，因此，可以利用多细胞生物类型的行为。这种能力允许在营养水平上的代谢合作，通过生物膜的不同行为体使得代谢产物的连续使用。由于在生物膜内建立的地理邻近性，这种形式的群体生活也促进了群体成员之间DNA片段和遗传物质的水平交换，从而促进新功能的获得。

1.3. 生物膜：休眠细菌的储存库

  这种被称为扩散的复杂现象是生物膜形成的最后阶段，是由营养消耗、氧浓度或细菌密度的变化等外部事件引起的（图4）。这些变化被细菌感知到，使细胞内信号激活，并最终导致部分生物膜的分离。因此，一些行为可以导致细菌或微聚集体的物理分离：基质降解酶（核酸酶、糖苷酶、蛋白酶）的合成和分泌，细菌的表面修饰导致粘附减少，表面活性剂的产生导致表面张力降低或某些细菌的裂解，这些现象往往会削弱生物膜的局部凝聚力。释放的细菌或细菌簇能够定植于其他表面，甚至由于它们的高毒性而产生其他感染点。

  信号、过量/缺乏、温度升高、氧气减少、pH值变化、细菌密度、宿主细胞信号、细胞死亡、细胞外基质紊乱、细菌表面结构扰动、鞭毛、多糖、群体感应、自诱导子细胞池、DGC关联复合物蛋白、PDE磷酸二酯酶、c-di-GMP水平细胞池、非生物或生物表面、皮毛、表面张力降低、无柄细菌、分散细菌、死亡细菌、蛋白质、基质降解酶、噬菌体。

2. 以生物膜作为衡量标准重新审视感染过程

  超过75%的人类感染被认为与组织或医疗设备表面上生物膜形式的微生物存在有关（图5）。这些是特定感染(骨感染、耳感染，…)或护理相关感染，通常继发于使用侵入性设备(导尿管、气管导管、导管…)，细菌在其表面形成生物膜（图6）。 [4] 然后细菌就会从宿主中分离出来，在其他表面定植，或者进一步渗透到身体的下游。继而导致慢性传染病，特别难以诊断和治疗。

  主要的相关细菌属于患者自身或来自患者环境的微生物群（例如：牙菌斑微生物群和心内膜炎、肠道微生物群和泌尿系统感染）。除了深层感染外，相关联的生物膜通常由几种细菌组成(参见人类微生物：我们健康的盟友)

  医疗器械生物膜相关感染、心室分流、隐形眼镜、气管内管、中心血管导管、心脏瓣膜假体、起搏器和血管植入物、乳房植入物、外周血管导管、导尿管、矫形植入物和关节假体、生物膜相关组织感染、（慢性中耳炎，慢性鼻窦炎、慢性心绞痛，牙菌斑，慢性喉炎）、心内膜炎、囊性纤维化时的肺部感染、肾结石、血管胆炎、尿路感染、骨骼炎、慢性伤口。

  不同微生物在同一生物膜内的共存可能会引发生态斗争，从而导致某一主体占据优势地位或在感染部位的水平上建立特定的生态位。但事实似乎并非如此，相反，物种的多样性有助于生物膜发展过程中的协同现象。因此，最近对两种细菌（金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌）的体外实验表明，其中一种细菌（金黄色葡萄球菌)表现得像一个先锋，有利于另一个(铜绿假单胞菌)后续定植。 [5]此外，由两种生物组成的生物膜最终所包含的生物量显著大于每一种单独采集的生物膜的生物量之和。

  同时存在的不同细菌也可以在从已形成的生物膜分离的过程中发挥积极作用，从而影响细菌在生物体内的选择性传播。在小鼠模型中，主要由肺炎链球菌引起肺部感染，致病细菌对金黄色葡萄球菌

  这些最近的数据有望有助于改变临床诊断方法。不仅要考虑病原体，还要考虑其生态系统以及在载体或感染位点水平上微生物之间的相互作用。因此，对整个微生物的整体分析，而不是对某一特定病原体的具体研究，将是特别重要的，尤其是在确定发生感染病理的高风险情况的预防方法中。

3. 抗生物膜的治疗策略或如何对抗生物膜？

  由于许多原因，与生物膜形成有关的感染的治疗特别微妙。除了几种细菌同时存在外，生物膜的生命形式使治疗更加复杂，因为生物膜细菌除了其自身的耐药性机制（遗传和个体）外，还对抗感染药物表现出特定的耐药性机制。[6]有一些因素导致了生物膜细菌对抗生素的“冷漠”：缺乏对某些分子的渗透，生物被膜深层氧气水平降低导致的效率低下，或者局部酸性。但最复杂的机制无疑是一些细菌在生物膜中采用的特殊生命形式，类似于一种休眠状态，代谢活动整体减少。抗生素由于缺乏细胞靶点而失效（见图2）。

  控制与传染病相关的生物膜意味着要么抑制其形成（预防策略)，要么分解现有的生物膜(治疗策略)，通过阻止活细菌的传播防止其在身体的其他部位定植(图7)。

3.1. 生物膜的预防策略

  几种预防性的抗生物膜策略已经被开发出来，以对抗不同阶段的生物膜形成。防止细菌在表面的初始粘附已经被广泛的研究，通过改变材料的物理化学结构，加入抗菌剂或在表面涂上抗粘附分子（生物表面活性剂）。这些分子的性质是相当多样化的，但许多细菌分子已经被研究过，包括胞外多糖，这表明细菌在竞争环境中构建生物膜时，自然地使用了这种策略。

  无论表面修饰的性质如何，这种方法都非常令人失望，因为这些材料很快会受到有机分子（如医疗设备中的胶原蛋白）制约，这些分子中和了抗粘附效应，甚至促进了细菌的早期定植。

  为防止长期使用的导管（透析导管)中生物膜的形成，通常是通过在使用期间以外将抗菌溶液(抗生素、乙醇)“封管溶液”引入设备的管腔中来实现的。如果这种做法被证明是有效的——阻止细菌的发展显然限制了聚集物的形成——高浓度抗生素的使用不可避免地会导致产生耐药性的生态风险。此外，这些溶液对材料完整性的影响仍然是未知的。

3.2. 抗生物膜的治疗策略

  根除已经形成的生物膜尤其困难。抗生素的使用不仅需要远远超出人类常规使用的剂量，而且某些分子还可能对生物膜的形成产生刺激作用。理想的处理应该能使生物膜不稳定，刺激休眠形式并对所有微生物发挥溶解作用。[7]文章已经描述了酶解生物膜基质的方法(糖苷酶，核酸酶)，但在单种生物膜中观察到有益的效果，通常很难推断出复杂的生物膜。

  另一种方法是通过中和负责细菌之间信号传递的分子来干扰调节机制。尽管这些信号网络非常复杂，但许多方法已经在实验模型中进行了研究，并取得了可喜的结果。然而，它们的实际应用很难实现；这些分子在细胞外基质中的隔离和它们在生物膜中的异质分布是这种创新方法的主要缺陷。在任何情况下，这种策略应该与杀菌处理相结合，以溶解从生物膜中释放出来的细菌，以防止它们定植于其他部位。这只有在这些细菌细胞具有代谢活性时才能实现。因此，不仅要破坏形成的聚集物，而且要复苏休眠细胞。有几种方法可以使用，最有效的是通过提供营养物质或破坏其细胞膜来促进其生长，从而诱导溶解过程。一些抗微生物肽（抗菌肽）能够在休眠细胞膜水平上发挥作用，对靶向细菌物种具有或多或少的特异性，并可能构成抗生物膜治疗库的重要元素。

  总之，当实施抗感染治疗时，大多数细菌组织成生物膜的能力是一个额外的问题。目前还没有制定有效的战略，但如果能更好地理解形成和维持这些聚集体所涉及的机制，就应能在不久的将来制订创新和有效的办法。

4. 要记住的消息

  我们对细菌世界的主要知识来自于对细菌的研究，这些细菌以个体细胞的形式在实验室中适当的培养基中生长。

  在自然界中，细菌主要以被称为生物膜的聚集群落的形式生存。这种生命形式使它们的行为协调一致，给了它们许多优势，特别是它们抵抗外部侵略的能力。

  这一发现深刻地改变了近几十年来细菌世界的研究方法，并对所有获得的关于致病菌和共生细菌(即我们的微生物群)的数据提出了质疑。

 

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参考资料及说明

封面照片：免版税的图片。

[1] Antoni van Leeuwenhoek (1632 – 1723) was a Dutch merchant and scientist. He is best known for his work on the microscope (thought to have been invented by Hans and Zacchary Jensen, or Galileo) of which he built many examples. He used this instrument to count the number of threads in a fabric and their thickness. His main idea was to observe the surrounding environment, and he was one of the first scientists to use the microscope to explore the world of microorganisms.

[2] William Costerton (1934 – 2012) is a Canadian microbiologist. A pioneer in the recognition of bacterial biofilms as the dominant mode of bacterial growth, Costerton demonstrated their importance in the resistance of bacteria to antibacterial agents and the persistence of certain chronic bacterial infections.

[3] McCoy W.F., Bryers J.D., Robbins J. & Costerton J.W. (1981) Observations of fouling biofilm formation. Can J Microbiol. 27(9):910-917; Zobell C.E. & Allen E.C. (1981) Observations of fouling biofilm formation. (1935) The significance of marine bacteria in the fouling of submerged surfaces. J Bacteriol. 29(3):239-251.

[4] Lebeaux D, Ghigo JM & Beloin C (2014) Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiol Mol Biol Rev. Sep;78(3):510-543. doi: 10.1128/MMBR.00013-14

[5] Alves P.M., l-Badi E., Withycombe C., Jones P.M., Purd K.J. & Maddocks S.E. (2018) Interaction between Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa is beneficial for colonisation and pathogenicity in a mixed biofilm. Pathogens Dis. 76, fty003; Reddinger R.M., Luke-Marshall N.R., Sauberan S.L., Hakansson P. & Campagnari A. (2018) Streptococcus pneumoniae modulates Staphylococcus aureus biofilm dispersion and the transition from colonization to invasive disease. mBio, 9 e02089-17

[6] Davies D. (2003). Understanding biofilm resistance to anti bacterial agents. Nat Rev Drug Discov 2:114-122; Lewis K. (2001) Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother 45:999e1007.

[7] Ko H., Allan R.N., Howlin R.P., Stoodley P. & Hall-Stoodley L. (2017) Targeting microbial biofilms: current and prospective therapeutic strategies. Nature Microbiol Rev. 15:740-754; Miquel S., Lagrafeuille R., Souweine B. & Forestier C.(2016) Anti-biofilm activity as a health issue. Front Microbiol. 7:592.

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译者：王跃辉          编审：段云峰          责任编辑：胡玉娇