“费城杀手”：嗜肺军团菌的出现——一种无处不在的环境细菌

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  1976年7月，正是酷热难耐、空调全速运转的季节，几百名美国退伍军人聚集在美国宾夕法尼亚州费城贝尔维尤·斯特拉福（Bellevue Stratford）酒店参加大会（见图1）。大会结束之后，周边城市连续几天突然流行重症肺炎：造成了147名退伍军人住院，29人（16%的比率）死亡，未发现典型病因。在亚特兰大疾病控制与预防中心(CDCP)的支持下，警方展开了一场真正的调查，以侦破“杀手”：几个月来它一直都不为人知。事实上，它是一种新的、对人类致病的细菌，后来称为“嗜肺军团菌”，这些细菌的栖息地是淡水环境。一种新的环境疾病由此诞生了，那就是“军团菌病”！

1. 50年前：军团菌病的出现

  两篇基础性的文章描述了这种“新”致病菌的发现情况和阶段，这种致病菌导致了这种致命肺炎的突然爆发。1977年12月1日，在疫情爆发一年半后，Fraser et al.[1]和J.E. McDade et al.[2]分别在著名医学杂志《新英格兰医学杂志》上发表了对肺炎疫情的描述和病原检测的诊断过程。他们的研究是受CDC[3]委托进行的。CDC是一个拥有强大的科学、技术和财政资源的美国联邦机构，其唯一目标就是找出美国媒体所称的“费城杀手”！

  从疫情开始，在众多微生物学家、化学家和毒理学家的支持下，流行病情报服务处（EIS）在该州部署了一个由大约50名流行病学家组成的小组(图2)。然而，对已知致病因子的全部搜索仍然没有结果。六个月后，McDade又回到了Robert Koch的假设，将死亡患者的肺组织切片接种到豚鼠体内，然后在胚胎卵子上进行亚种培养，最终可以观察到细菌形态！在接下来的一年里，该疾病的主要特征和引发感染的病原体被定义为:“由革兰氏阴性杆菌引起的肺炎，难以培养，最常发生在高危人群(老年人、吸烟者)中，死亡率为10%，通过呼吸道进入，可能的传播原因：空调系统”。全世界的媒体都报道了这一流行病，鲍勃·迪伦的歌曲《军团菌病》也使这一流行病“名垂千古”！

  在尽管如此，因为这种疾病的严重性和它在社区获得性肺炎(仅次于肺炎球菌的第二大死因)中所占的比例很高，这种疾病仍然是人们所关注的热点，特别是在法国(2018年有2133例)。

2. “致命细菌”嗜肺军团菌的身份证

2.1. 什么是嗜肺军团菌

  1979。这是一种小型需氧革兰氏阴性菌[3]，由此产生了一个称为军团菌科（为了纪念首例受感染的病人）的新的科。该军团菌科只有一个军团菌属（图3）。为了提醒我们它所引起的疾病：肺炎，第一个物种被称为嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）(Philein：爱；Pneuma：呼吸）。到目前为止，人们已经描述了65种物种，其中只有大约20种是在人类和环境中共同发现的。一个显著的现象：它的耐热性。这种细菌在25到45摄氏度的温度下开始繁殖。它可以在高达60摄氏度的温度下存活，但在70摄氏度以上的温度下就会死亡。

  最初，细菌无法在现有的培养基上繁殖。1979年，一种新的具体环境描述了，这种培养条件在今天仍然适用。细菌分裂时间平均为4小时；一方面，它解释了菌落出现在培养物中所需的时间，在2到5天之间（图4），另一方面，它解释了疾病的潜伏时间在4到10天之间。识别菌落的几种方法是可行的：以前很快被放弃的生化技术现在通常被免疫凝集试验或质谱法取代（MALDI-TOF-MS [4],[6]）。

  今天，人们已经描述的嗜肺军团菌已不再是一种，而是65种，其中，最常见和最具致病性的是人类嗜肺军团菌L.pneumilsg（血清型）1。这种菌的致病性主要是由于存在大量参与细胞内增殖的因子，包括巨噬细胞感染增强剂（MIP）和三个分泌系统，其中最重要的是IV型[7]。在已测序的菌株中，巴黎嗜肺军团菌和Lens嗜肺军团菌显示出一个370万个碱基对（Mbp）的基因组差异。他们的分析特别表明，存在与两个已知宿主（自由生活的变形虫[5]和人类）具有相同同源性的蛋白质编码基因。随后，人们对来自不同宿主的同源蛋白进行了表征，这解释了这种微生物的适应能力[8]，特别是对人类最致病的物种：嗜肺军团菌血清型1的适应能力。

2.2. 嗜肺军团菌的生物群落是什么？

  军团菌的自然栖息地是各种各样的淡水：湖泊、河流、池塘（图5）和温泉水。然而，它们在海水中不存在[9],[10]。这种水生和大地水生[6]细菌可以以三种不同的形式存在于自然环境中：

• 在自由生活的变形虫中：这种非寄生性原生生物[7]完全在环境和水中通过吞噬作用以微生物（包括军团菌）为食来完成其生命周期。它们对变形虫也有一种天然的“抗性”；它们将自己内化在一个称为含军团菌的液泡（LCV）中，该液泡构成了环境中拥有特权的繁殖场所；从而使军团菌能够“庇护”在变形虫中并抵抗环境压力（图6）[11]。这些真核生物（棘阿米巴属、哈特曼氏菌属等）现在成为潜在的污染源。

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  在细菌生物膜[8],[12]中：生物膜（参见细菌生物膜和健康）由动态环境组成，其中封闭在细胞外基质中的组合在一起的微生物粘附在理化表面上：该模型适用于军团菌。但是这种生物膜也可以在停滞的液体介质或“漂浮的生物膜”的表面上发现：这些在水池中的细菌因为这种生物膜而不能触达，并且因为细菌生物膜的持续存在，导致很难用消毒剂产品根除。

• 以可存活但不可培养的细菌（VBNC）[13]的形式：这些细菌是在压力的影响下出现的，这意味着它们由于代谢活性低而无法暂时繁殖。然而，如果条件再次变得有利，它们可以恢复其致病性。

  人工或人造水塔：空气冷却塔（图7）和生活热水（DHW)装置[14]、[15]。如果温度允许（25到45°C），军团菌可以从自然地点移居到人造地点并繁殖。因此，任何包含热水的设备或网络都将构成军团菌的潜在生态位。从历史上看，空调系统、冷却塔和蒸发式冷凝器也受到牵连：因此，“空调”一词通常与“军团病”一词同义！后来证明，所有“现代”家用热水网络都有可能被军团菌占领，并且在一些区域风险更高，例如淋浴、漩涡、装饰性喷泉等。

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  空气冷却塔装置是第一个与疫情爆发直接相关的装置。用于空调（工业、商业）的工业热水回路或制冷装置有利于军团菌的繁殖（装置中的水温和空气/水接触）。位于建筑物外的潮湿空气冷却塔是这些热回路的冷却系统，导致从通风口释放到空气中的细小液滴组成的气溶胶的形成。风险的程度或大或小取决于周围人口的位置和密度。例子比比皆是，高尔夫球手的公共汽车站位于落尘下，建筑物本身或邻近建筑物释放的蒸气不自觉地回收。涉及工业冷却塔的风险较少。尽管如此，Lens（1997）的爆发确定是由于距离受污染患者家8公里，甚至16公里的冷却塔（图8）！

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  生活热水（图9和图10）最初是供家庭使用的冷水，供人类消费，然后进行二次加热。这是苏珊·费舍尔-霍克（Susan Fisher-Hoch）观察到英国不普遍使用空调的案例后发现的第二个污染区域[16]。通过供应网络分配给家庭的水以多种方式进行加热，比如锅炉、热水箱等。这些方式可以是单独的，也可以是集体的。然后它通过一个中等大小的管道分配到任何出水口（水龙头、淋浴），在那里它变成生活热水。

  如果温度条件允许，可能以非常低的浓度存在于冷水中的军团菌，将能够迅速繁殖。受污染的热水在转化为气溶胶时会变得危险：例如，淋浴、水疗、雾化器和喷雾装置、装饰喷泉，甚至是洗车装置和牙科用喷水器中的水就是这种情况。

  在医院，污染的风险是相同的，但是随着免疫已经受损（免疫抑制）的患者入院或接受治疗（皮质类固醇治疗），污染的风险大大增加。2001年乔治·蓬皮杜欧洲医院落成典礼期间发生的军团菌病流行仍然是一个教科书般的案例，强调了管道组成的重要性以及这些管道中水停滞的时间段的重要性。

  其他潜在的地点，虽然比较少见，包括潮湿的土壤，例如“盆栽土壤”，其中的堆肥可能被特定物种L.longbeachae污染，该物种对人类也具有致病性。

2.3. 细菌是如何在人类中出现的？

  现在已经证明，人类感染是通过吸入被军团菌污染的热水气溶胶发生的：飞沫小于5 µm，但大到足以容纳细菌（直径大于2 µm）[17]。由于肺巨噬细胞是天然的“肺清洁器”并能破坏被摄入的微生物，因此任何健康的受试者在微生物暴露期间通常都能够保护自己。但如果在吞噬过程中出现异常，或者感染菌株具有特定的毒力，或者细菌浓度高，那么巨噬细胞就会转化为“意外宿主”。军团菌在吞噬溶酶体液泡（LCV）中繁殖，就像在变形虫中一样，然后以增加的毒力逃逸（细菌再次长出鞭毛）。这一过程主要见于嗜肺军团菌，该种属占所有军团菌病病例的90%以上（图11）。该细菌被归类为细胞内繁殖细菌，这将需要使用具有细胞内扩散的抗生素来治疗。

  这些特殊性表明军团菌病不是人类传染病（2016年在葡萄牙仅记录了一个例外），而是一种机会性疾病，其发生在很大程度上取决于许多个人风险因素！

2.4. 什么是军团菌病？

  军团菌病是一种肺炎[17]，在暴露后潜伏期约为5天；感染剂量为每升1000 CFU（菌落形成单位）嗜肺军团菌。有些人群比其他人群更“处于危险之中”（尽管在20% 到30% 的情况下，没有检测到风险因素）。现在已经很好地确定了三个促成因素：

• 年龄超过50岁（军团菌病在儿童和年轻人中很少见）；
• 吸烟者（45% 的病例）；
• 男性（75% 的病例）。

  其他免疫系统较弱（恶性血液病、癌症、免疫抑制治疗、长期皮质类固醇治疗）、慢性心脏或肺部疾病和糖尿病的患者需要采取严格的监管和监督的预防和监测措施，包括强制性的“零军团菌” 生活热水（DHW）的阈值。

  临床上，该疾病有两种不同的形式：庞蒂亚克热（没有肺炎的流感样症状；症状在不治疗的情况下在2到5天内消失，潜伏期为几小时到48小时）。军团病是一种严重的临床和放射学肺炎，可引起流感样症状，但没有特异性体征。如果不治疗，10% 的病例会发生死亡。适当的抗生素治疗（抗生素治疗细胞内的战斗细菌，如大环内酯类、氟喹诺酮类或利福平）可作为治疗处方。它符合美国国家药品和健康产品安全局（ANSM）[18]的建议，该建议考虑了感染的严重性，预计恢复时间不到1个月。

  军团菌病是一种严重的疾病，因此准确诊断对于治疗目的和监测目的都很重要。它基于与肺炎的关联以及以下4项微生物标准中至少一项标准[19]（图12）：

1. 1. NOW Legionella 尿检中存在军团菌可溶性抗原（图13）；
   2. 使用直接PCR技术对支气管肺样本进行细菌DNA分离；
   3. 从肺部样本（痰或支气管肺泡灌洗液）中分离细菌培养物，然后对分离的菌株进行编码；
   4. 如果证明血清转化，则可以进行后验确认。

3. 今天人们对法国和欧洲的军团菌病的流行病学有哪些了解？

  流行病学是医学科学的一个分支。它研究一种疾病在大量人群中的发生率和流行率，并检测这种疾病的来源和病原体。

  对军团菌病爆发的流行病学调查被认为具有根本重要性。军团菌病被认为是一个重大的公共卫生问题，它被列入必须强制申报的疾病清单。在法国，自1987年以来，这种疾病的通报是强制性的。所有新病例都需要报告并发出通知。由于可靠的诊断测试（在尿液中寻找可溶性抗原——1997年）的可用性以及将分离的菌株传输到里昂的“Centre National de Référence (CNR) des Legionelles”的义务[20]</a——法国存在一个有效的监测系统（图14）。这是基于对从军团菌病感染患者中分离的军团菌菌株和从环境中分离的菌株的研究。CNR的目的是确定污染源。“疾病与环境”菌株的比较研究基于各种编码方法（表型[9]，基因组）。

  今天，不同数据分析方法的出现让人们对流行病学的描述变得可靠：

• 监管机构已实施指导方针，要求根据生物检测结果将所有军团菌病病例记录和分类为“确诊”或“可能”；
• 根据获得疾病的地点对“医院[10]病例”或“社区病例”进行分类；
• 根据受同一菌株影响的人数记录疾病的传播情况：孤立病例或分组病例或流行病例（见表1）；和
• 最后，欧洲军团菌监测网络EldsNet[21]</a报告了与前往法国以外的其他国家旅行有关的病例。

表1. 2018年军团菌病病例流行病学数据摘自《Data de Santé Publique France 2019》（见参考文献[19]）

  从2018年法国军团病流行收集的数据（2019年8月公布的数据）突出了该疾病的不同特征，如表1中所总结；在其评论Santé Publique France[22]</a中，强调了明显增加的是：2,133例病例和3.2% 的全国发病率，这是自1988年开始监测以来记录的最高数字。

  除了6月份病例净增加（有利的气象因素）、大量零星病例和没有新的危险因素外，没有找到特别的原因来解释这一点。

  在欧洲，病例通知由ECDC（欧洲疾病预防和控制中心）负责。这种监测活动在三十个欧洲国家有效。报告病例数从2013年的5,835例增加到2017年的9,238例[23]</a。发病率为1.8/100,000居民。

  报告军团菌病病例最多的四个国家是：第一，意大利：2013例；法国位居第二：1,630例；西班牙排名第三：1,363例；排在第四位的德国：1,280例。但应谨慎解释这些数字，因为并非所有国家/地区都使用最新的诊断方法。然而，人们认为目前使用的测试和现有的监测系统对数据的准确性非常重要。

  请注意，美国2014年的年发病率为每10万居民1.62 例，比自2000年报告的0.42例有所增加。

4. 是否有可能预防军团菌病？

4.1. 我们如何监测水质系统？

  没有疫苗可以预防军团菌病！因此，整个预防策略是基于个人或集体措施。

  针对生活热水和冷却塔系统的预防措施基于若干基本法规文本[24]</a：公共卫生高级委员会调查和管理援助指南，2013年7月11日—2010年2月1日法令—12月通告2010年12月14日—2013年12月14日的法令。

  规范生活热水使用的一般准则（参见法兰西岛地区卫生局发布的监测表）是：

  无论是个人使用还是集体使用，都需要持续控制热水储水箱的温度，必须始终：

• 生产结束时高于55°C；
• 在任何分配点高于50°C；
• 冷水的温度必须低于20°C。

  必须通过清除管道系统中的积水、检查管道是否存在腐蚀、为水龙头和淋浴喷头除垢以及纠正供水网络的不良维护等做法来确保对热水装置进行定期维护和监控。

  个人“在家”预防。除了上述规则外，还需要采取两个重要的预防措施：

• 在长时间离开物业后（例如假期），必须让所有热水龙头和淋浴喷头运行几分钟。
• 谨慎使用很少使用的供水点，因为它们是军团菌的潜在储存库。

  根据其人为活动，危险装置分为两类：

  A组：存在军团菌传播高风险的设施：

• A1：在一个或多个城市的区域内（测量数百平方米或数平方公里）。这是安装在建筑物或工业场所的屋顶安装式冷却塔的情况，用于空调要求。污染是由热水蒸气释放到大气中引起的。为防止此类污染，必须定期维护、清洁和使用杀菌剂对冷却塔进行消毒。
• A2：公共水源周围几平方米：集体生活热水系统。

  B组：

• B1：集体水雾设备、水疗中心、洗车机、污水处理厂的泻湖系统、专业高压清洗机。
• B2：用于氧疗、睡眠呼吸暂停、雾化、牙科护理的设备。

4.2. 我们怎么知道供水网络被污染了？

  AFNOR标准 NF T 90-431对供水网络系统的研究进行了很好的编码：“水质-军团菌属和嗜肺军团菌的搜索和计数”。这是一种直接接种和经过浓缩后的方法。它适用于所有类型的水：干净的和脏的。自2010年以来，采用分子生物学型PCR检测的NF T90-471标准已经存在：该技术是在卫生当局提出特定要求的情况下进行的。

4.3. 公共机构的义务是什么？

  对于这些机构，必须适用2010年2月1日的法令和2010年12月21日的通知（参见参考文献[19]），以防止生活热水系统受到污染。它们涉及在医疗机构、医疗社会设施和监狱、酒店和旅游住宅、露营地和其他向公众开放的机构中处理生活热水供应、储存和分配的设施中的军团菌监测。

  可在Internet上查阅的其他准则，它们专门适用于向公众开放的从露营地到酒店的所有类型的机构：

• 温泉和游泳池的军团菌监测，
• 温泉军团菌监测，
• 洗车机军团菌监测，
• 旅游场所的军团菌监测，
• 冷却塔军团菌监测（2014年1月20日），
• 对住宅建筑的建议。

  关于医院，来自法国总检察院和法国卫生高级委员会的通告的分发已帮助医疗保健专业人员了解住院患者的风险，并导致应对指南的制定。在该领域，医院感染控制委员会（CLIN）和卫生部门已制定程序，包括建立“水质监测日志”[25]</a。

4.4. 万一被污染怎么办？

  如果水系统被军团菌污染，系统操作员必须立即根据风险级别采取适当的措施[26]</a。

  对于简单的消毒干预，可以应用多种处理措施，单独使用或联合使用。他们是：

• 机械（方面）的：管道除垢或修理；
• 物理的：特别是热冲击。仅用于热水系统，它包括将水温保持在70°C至少30分钟。此流程已在中型医院使用，但在供暖过程中，没有人可以使用水，并且每个使用点都需要有人在场，以避免烫伤；或者
• 化学的：这些是高度受控的化学试剂，其中主要是产生次氯酸盐的氯化物。

5. 要记住的消息

• 在20世纪70年代和80年代，出现了三种主要的细菌性传染病：(1)引发莱姆病的伯氏疏螺旋体，(2)导致胃溃疡的幽门螺杆菌和(3)嗜肺军团菌和军团菌病。
• 每一次，都是偶然的情况导致了致病细菌的发现。事实上，它们已经存在了很长时间，只是被忽视了！
• 军团菌肯定早在费城疫情爆发之前就存在于环境水体中，但由于它们还没有机会感染人类，所以它们并不为人所知。
• 正是我们人类对热水的需求，以及其对舒适、娱乐或工业需求的多种用途，才导致了一种全新的、完全不可预测的疾病。
• 因为军团菌在淡水环境中无处不在，所以不可能在环境中根除它。
• 我们所有人都有责任促进和执行严格的规定，以正确使用热水并防止其发生污染。为保护处于最“危险”中的人，这些规则首先必须付诸实施。

作者感谢Krysha Marca夫人在法文原文译成英文方面提供了宝贵的帮助。

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参考资料及说明

封面照片：一些新闻报道。

[1] Fraser DW, Tsai TR, Orenstein W. et al Legionnaires’ disease: description of an epidemic of pneumonia. N. Engl. J. Med.1977, 297, 1189-1197

[2] McDade JE, Shepard CC, Fraser DW et al. Legionnaires’ disease. Isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease. N. Engl. J. Med. 1977, 297, 1197-1203

[3] https://www.cdc.gov/

[4] Thomas G. & Morgan-Witts M., Trauma – The search for the cause of Legionnaires’ disease. Arrow Books, 1981; Thomas G. & Morgan-Witts M., Trauma – In search of a murderous virus, French translation by Destanque P., Ed. Encre 1982

[5] Brenner DJ, Steigerwalt A.G. McDade J.E. Classification of the Legionnaires’ Disease bacterium: Legionella pneumophila, genus novum, species nova of the family Legionellaceae, familia nova. Ann. Intern. Med. 1979, 90, 656-658.

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[7] Mish EA. Legionella: virulence factors and host response. Curr. Opinions. Infect. Dis. 2016, 29, 280-286

[8] Gomez-Valero L., Rusniok C., Carson D. et al. More than 18,000 effectors in the Legionella genus genus provide multiple, independent combinations for replication in human cells. Process Nat. Acad. Sci. USA 116 (6) 2265-2273; first published January 18, 2019 https://doi.org/10.1073/pnas.1808016116

[9] Fliermans C.B., Cherry W.B., Orisson L.H., Smith S.J., et al. Ecological distribution of Legionella pneumophila. Appl. Environm. Microbiol. 1981, 41, 9-16

[10] Orisson L.H., Cherry W.B., Fliermans C.B. et al. Characteristics of environmental isolates of Legionella pneumophila. Appl. Environm. Microbiol. 1981, 42, 109-115

[11] Molmeret M. et al. Amaoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens. Appl. About. Microbiol. 2005; doi:10.1128/AEM.71.1.1.20-28.2005

[12] Lau H.Y. &Ashbolt N.J. The role of biofilm and protozoa in Legionella pathogenesis: implications for drinking water. J. Appl. Microbiol. 2009,107,368-378; Steinert M., Hentschel U.& Hacker J. Legionella pneumophila: an aquatic microbe goes astray. FEMS Microbiol. Rev. 2002, 26, 149-162; Declerck P. Biofilms: the environmental playground of Legionella pneumophila. Env.Microbiol.2010, 12, 557-566; Abdl-Nour, Duncan C, Low D.E et al . Biofilms: the stronghold of Legionella pneumophila. Int J. Mol. Sci. 2013, 14, 21660-21675

[13] Dietersdorfer E., Kirschner A., Schrammel B. et al Starved viable but non-culturable (VBNC) Legionella can infect and replicate in amoebae and human macrophages. Water Res. 2018

[14] Fields B.S., Benson R.F. & Besser R.E. Legionella and Legionnaires’ Disease: 25 years of investigation. Clin. Microbiol. Rev. 2002, 13, 506-526

[15] Cunha B.A., Burillo A.&Bouza E. Legionnaires’ disease. Lancet 2016, 387, 376-385

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[17] Jarraud S., Reyrole M., Meugnier H. et al Légionellose. Presse Med 2007, 36, 279-87; Jamilloud Y., Jarraud S., Lina G., et al. Legionella, legionellosis, 2012, Med Sci (Paris) 28, 639-45

[18] ANSM：国家药品和健康产品安全局（取代 AFSSAPS），一个法国机构

[19] 2018年法国发生的军团菌病病例评估（2019年8月） Santé Publique France. https://www.santepubliquefrance.fr/maladies-et-traumatismes/maladies-et-infections respiratoires/legionellose/articles/bilan-des-cas-de-(in french)

[20] 法国国家军团菌参考中心。 http://cnr-legionelles.univ-lyon1.fr/

[21] ELDSNet：欧洲军团病监测网络，由 ECDC（欧洲疾病中心）协调预防和控制），创建于 2005 年。 EWGLI（欧洲军团菌感染工作组）创建于 1986 年，将成为 EWGLINET，然后在 2010 年成为 ELDSNet。

[22] 法国公共卫生。自2016年5月1日起，它已包括：INVS（Institut National Veille Sanitaire）、Inpes（Institut national预防和健康教育），Eprus（建立对突发卫生事件的准备和响应）。

[23] European Centre for Disease Prevention and Control, Legionnaires’ disease. In: ECDC. Annual epidemiological report for 2017 (2019), Stockholm.

[24] https://www.hcsp.fr notices and reports/guide for investigation and case management assistance in legionellosis, https://www.iledefrance.ars.sante.fr/la-legionellose (in french)

[25] Cheron J. (2006) Maîtriser le risque légionelles. Ed. Johanet, 325 p. (in french)

[26] 军团菌病的预防：按安装和设施类型划分的义务

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译者：刘鲁          编审：段云峰          责任编辑：胡玉娇